营养●科普
当前位置：首页营养●科普一等奖论文：食品中氨基酸含量的测定方法学研究

一等奖论文：食品中氨基酸含量的测定方法学研究

时间：2023-01-07 21:32:53     浏览次数： 次

李艳婷
（山西农业大学山西功能食品研究院，山西太原030031） 
 
摘要：参考国标GB 5009.3食品安全国家标准食品中氨基酸的测定，对氨基酸片中16种水解氨基酸进行了测定和方法学验证分析。结果表明，该测定方法具有线性关系良好、结果准确、重现性好、回收率高的特点，可用作为食品中16种水解氨基酸的测定方法。测定得到了天灿氨基酸片的天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸含量，试验结果可为食品中的氨基酸测定方法提供参考依据。
关键词：食品；水解氨基酸；方法学研究
 
Methodological study of determination of amino acid content in food
LI Yan-ting
(Shanxi Institute for Functional Food, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030031, China)
Abstract: In this experiment, 16 kinds of hydrolyzed amino acids were determined and analyzed based on the national standard GB 5009.3. The results showed that the improved method had good linear relationship, accurate results, good reproducibility and high recovery, so it could be used as a method for the determination of 16 hydrolyzed amino acids. The contents of aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine and proline in Tiancan amino acid tablets were determined. The results of this study can provide a reference for the determination of amino acids about other food.
Key words: Food; hydrolysis amino acid; Methodological study

      氨基酸是自然界中一类重要的生命物质，是肽、蛋白质、酶等生物大分子的基本单元, 易被肠道吸收并在肝脏内分解或合成蛋白质，或随血液分布到其他组织器官合成特异性的组织蛋白质，起到生理调节的作用[1]。对于人体而言，所需氨基酸约有20多种，其中有8种是人体 不能合成的，必需由食物中提供，叫做“必需氨基酸”，包括：色氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和组氨酸，而其他的则是“非必需氨基酸”。如果人体缺乏任何一种必需氨基酸，都可导致生理 功能异常，甚至导致疾病。同样，如果人体内缺乏某些非必需氨基酸，也会产生抗体代谢障碍。因此，氨基酸在人体中的存在，不仅提供了合成蛋白质的重要原料，而且对于促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础[2-3]。

       氨基酸分析在食品、药学、饲料和临床研究上有着广泛而重要的作用,是生物化学、生化制药、生物工程的重要研究对象。因此,对氨基酸的分离分析一直是分析化学研究的重点内容之一[4]。在食品成分的分析当中, 对于氨基酸的分析是十分重要的一个部分, 一般对氨基酸的检测方法有氨基酸分析仪法、高效液相色谱法等多种方法。而在实际的食品成分检验过程当中, 氨基酸分析仪法具有操作简单等许多优势。蚁碧珍等[5]、李磊等[6]、侯婷婷[7]等均采用氨基酸分析仪法对食品中的氨基酸含量进行了测定。本实验参考国标GB5009.3《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[8] ，采用S-433D 型全自动氨基酸分析仪，对氨基酸片中16种水解氨基酸进行了测定和方法学验证分析。

1材料与方法
1.1材料
天灿氨基酸片（国食健注G20120506）。

1.2仪器
S-433D 型全自动氨基酸分析仪（塞卡姆科学仪器有限公司）；TVE-1100试管浓缩仪（上海爱朗仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；水浴氮吹仪器（上海那艾精密仪器有限公司） 等。  
  
1.3方法
1.3.1样品测定液制备
参考国标GB5009.3制备固体样品和液体样品测定液，供仪器测定用[8]。

1.3.2氨基酸混合标准工作溶液制备
氨基酸混合标准工作溶液 [c=500nmol/mL]的制备：精密量取氨基酸混合标准溶液[c=2.5μmol/mL] 2mL，置于10mL容量瓶中，用pH=2.2的样品稀释液（柠檬酸钠缓冲液）定容至刻度。
精密移取氨基酸混合标准工作溶液0.02 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.50mL、1mL、1.5mL、2mL，分别置于10mL容量瓶中，用pH=2.2的样品稀释液（柠檬酸钠缓冲液）定容至刻度，摇匀，得浓度为1 nmol/mL、5 nmol/mL、12.5 nmol/mL、25 nmol/mL、50 nmol/mL、75 nmol/mL、100 nmol/mL的系列标准工作曲线。

1.3.3测定条件
色谱柱编号： 0208167        LCA  K06/Na 4.6×150mm       
柱温： 58℃                 反应器温度：130℃
流速：0.25mL/min            进样量：  50μL

2结果与分析
2.1标准曲线的制作
准确吸取氨基酸混合标品溶液 0 、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中显色后，在 570 nm 处测天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸含量，在 440 nm 处测脯氨酸含量，以各氨基酸实际浓度(x)对峰面积(y)作线性回归，得其回归方程如表1所示。结果表明，16种氨基酸线性关系在1～100 nmol/mL 范围内良好。 

表1  氨基酸线性试验结果
编号 氨基酸名称 线性回归方程
1 Asp y = 74.6x + 83.94      r = 0.999
2 Thr y = 74.89x + 90.78     r = 0.999
3 Ser y = 76.51x + 121.3     r = 0.999
4 Glu y = 76.02x + 98.08     r = 0.999
5 Gly y = 75.11x + 37.25     r = 0.999
6 Ala y = 74.91x + 34.55     r = 0.999
7 Val y = 76.17x + 169.7     r = 0.999
8 Met y = 68.14x + 59.43     r = 0.999
9 Ile y = 75.72x + 49.90     r = 0.999
10 Leu y = 77.11x + 49.49     r = 0.999
11 Tyr y = 75.15x + 191.0     r = 0.999
12 Phe y = 74.68x + 88.50     r = 0.999
13 His y = 74.82x + 64.57     r = 0.999
14 Lys y = 83.26x + 26.38     r = 0.999
15 Arg y = 70.00x - 8.782      r = 0.999
16 Pro y = 19.27x - 4.003      r = 0.999
 
2.2重复性试验
称取6份氨基酸片粉末0.003g，按1.3.1的方法进行处理制备样品测定液，上机测定，计算结果，其RSD均小于10%，表明方法重复性良好。

表2  16种氨基酸重复性试验结果
编号 名称 Y1
(g/100g)		 Y2
(g/100g)		 Y3
(g/100g)		 Y4
(g/100g)		 Y5
(g/100g)		 Y6
(g/100g)		 平均值(g/100g) RSD
1 Asp 6.6284 7.2368 7.2282 6.8588 6.7854 6.6621 6.900 3.92%
2 Thr 4.6940 5.0811 5.1211 4.8207 4.8129 4.8615 4.899 3.41%
3 Ser 1.8936 2.0636 2.0452 2.0060 1.9378 2.0408 1.998 3.39%
4 Glu 6.1059 6.6764 6.6060 6.4112 6.2148 6.0961 6.352 3.97%
5 Gly 5.8277 6.3076 6.3745 5.9686 5.9513 5.8125 6.040 4.01%
6 Ala 5.2799 5.7486 5.7822 5.4337 5.4205 5.3270 5.499 3.90%
7 Val 0.121 0.111 0.110 0.107 0.105 0.104 0.11 5.64%
8 Met 0.615 0.667 0.666 0.741 0.705 0.736 0.69 7.01%
9 Ile 7.5009 8.1342 8.1580 7.8785 7.7786 7.6746 7.854 3.29%
10 Leu 1.1695 1.2673 1.3114 1.2430 1.2515 1.2108 1.242 3.91%
11 Tyr 5.3713 5.4570 5.5533 5.1771 5.0753 4.9147 5.258 4.64%
12 Phe 4.1045 4.4253 4.4921 4.2475 4.1805 4.0790 4.255 3.99%
13 His 6.9823 7.6904 7.6267 7.2178 7.1931 6.9981 7.285 4.20%
14 Lys 2.9020 3.1671 3.1665 2.9698 2.9519 2.8896 3.008 4.21%
15 Arg 3.2352 2.9723 2.7367 2.4761 2.5193 2.4964 2.739 11.27%
16 Pro 6.6284 7.2368 7.2282 6.8588 6.7854 6.6621 6.900 3.92%
 
 
2.3精密度试验
选用100nmol/mL的标准混合溶液进行精密度的考察，记录响应值，结果如表3所示，RSD均小于10%，表明精密度良好。

表3  16种氨基酸精密度试验结果
编号 名称 Y1
(g/100g)		 Y2
(g/100g)		 Y3
(g/100g)		 Y4
(g/100g)		 Y5
(g/100g)		 Y6
(g/100g)		 平均值(g/100g) RSD
1 Asp 7455.119 7469.147 7497.418 7458.177 7429.585 7444.995 7459.073 0.28%
2 Thr 7166.507 7589.435 7633.784 7574.730 7555.069 7198.423 7452.991 2.59%
3 Ser 7251.116 7762.051 7791.449 7746.681 7710.314 7328.036 7598.275 2.90%
4 Glu 7680.876 7728.378 7769.449 7722.068 7607.048 7709.853 7702.945 0.65%
5 Gly 7440.578 7486.119 7570.518 7596.424 7524.397 7453.471 7511.918 0.77%
6 Ala 7478.334 7482.526 7551.816 7653.972 7416.845 7490.607 7512.350 0.99%
7 Val 7819.168 7798.829 7848.932 7714.086 7688.996 7777.887 7774.650 0.73%
8 Met 6892.455 6811.147 6906.869 6768.287 6832.933 6724.222 6822.652 0.94%
9 Ile 7115.540 7057.776 7678.061 7173.751 7631.039 7243.254 7316.570 3.36%
10 Leu 7312.463 7305.857 7828.599 7256.458 7771.060 7506.377 7496.802 3.05%
11 Tyr 6603.558 6796.212 7747.957 6851.285 7555.155 6892.558 7074.454 5.96%
12 Phe 6828.444 6882.034 7617.486 6826.763 7581.263 7063.188 7133.196 4.75%
13 His 7555.949 7591.093 7617.474 7702.436 7626.115 7624.443 7619.585 0.58%
14 Lys 8239.831 8331.833 8299.457 8224.999 8186.564 8353.734 8272.736 0.72%
15 Arg 6984.344 6976.437 7065.979 7016.367 6981.649 6984.797 7001.596 0.45%
16 Pro 1922.743 1966.863 1942.719 1963.024 1884.907 1992.652 1945.485 1.78%
 
 
2.4回收率试验
用高、中、低3个浓度的标准品加入法测定回收率，结果如表1 。回收率为均在80%～120%范围内， RSD均小于10 %，表明回收良好。

表4  16种氨基酸回收率试验结果
编号 名称 低回收率 中回收率 高回收率
平行样/% 平均值/% RSD
/%		 平行样/% 平均值/% RSD
/%		 平行样/% 平均值/% RSD
/%
1 Asp 102.28
98.48
95.35		 98.70 3.51 85.95
80.47
88.50		 84.97 4.83 96.47
89.11
98.53		 94.70 5.23
2 Thr 102.26
105.65
100.74		 102.89 2.44 93.31
91.63
92.43		 92.46 0.91 94.03
96.63
93.55		 94.74 1.75
3 Ser 99.66
109.35
104.57		 104.52 4.64 95.77
93.37
91.88		 93.67 2.09 88.91
93.16
93.30		 91.79 2.71
4 Glu 98.73
97.27
83.96		 93.32 8.72 88.07
84.32
94.77		 89.05 5.94 81.22
85.39
82.95		 83.19 2.52
5 Gly 99.80
106.88
103.76		 103.48 3.43 91.05
82.03
85.81		 86.30 5.25 97.89
88.88
90.86		 92.54 5.12
6 Ala 93.63
102.06
94.39		 96.69 4.82 88.77
82.91
80.81		 84.16 4.90 96.34
95.15
100.84		 97.44 3.08
7 Val 103.28
102.47
100.48		 102.08 1.41 88.40
83.69
80.91		 84.33 4.49 99.63
96.27
101.98		 99.29 2.89
8 Met 88.76
90.54
90.54		 89.95 1.15 82.02
80.25
81.30		 81.19 1.09 83.77
87.58
83.33		 84.89 2.75
9 Ile 103.60
100.25
100.49		 101.45 1.84 95.05
96.47
83.96		 91.83 7.46 101.84
97.59
97.05		 98.83 2.66
10 Leu 110.19
96.80
97.90		 101.63 7.32 93.73
90.23
81.73		 88.57 6.97 99.38
95.28
95.97		 96.88 2.26
11 Tyr 96.80
103.46
96.50		 98.92 3.98 110.15
102.92
94.86		 102.64 7.46 109.24
106.02
110.40		 108.55 2.09
12 Phe 88.49
90.83
93.48		 90.94 2.75 93.49
91.82
83.06		 89.46 6.26 102.65
97.38
101.12		 100.38 2.70
13 His 99.98
98.36
96.65		 98.33 1.69 94.90
89.40
93.09		 92.46 3.03 104.48
100.88
97.84		 101.07 3.29
14 Lys 101.70
101.21
94.12		 99.01 4.28 84.73
88.37
80.65		 84.58 4.57 100.49
106.34
106.88		 104.57 3.39
15 Arg 84.95
86.57
86.55		 86.02 1.08 82.17
83.73
83.29		 83.06 0.97 83.57
82.51
86.50		 84.19 2.45
16 Pro 80.32
85.63
87.70		 84.55 4.50 89.63
80.90
81.56		 84.03 5.79 96.09
98.28
94.94		 96.44 1.76
 
 
2.5检出限与定量限
取阴性样品2g，分别加入浓度为0.4nmol/mL和1nmol/mL的氨基酸混合标液1mL按1.3.1方法处理上机测试，16种氨基酸的信噪比均大于3和10，故样品中16种氨基酸的检出限与定量限如下表所示。
表5 检出限与定量限试验结果
编号 名称 检出限（g/100g） 定量限（g/100g）
1 Asp 0.000100 0.000333
2 Thr 0.000089 0.000298
3 Ser 0.000079 0.000263
4 Glu 0.000110 0.000368
5 Gly 0.000056 0.000188
6 Ala 0.000067 0.000223
7 Val 0.000088 0.000293
8 Met 0.000112 0.000373
9 Ile 0.000098 0.000328
10 Leu 0.000098 0.000328
11 Tyr 0.000136 0.000453
12 Phe 0.000124 0.000413
13 His 0.000116 0.000388
14 Lys 0.000110 0.000366
15 Arg 0.000131 0.000436
16 Pro 0.000086 0.000288
 
 
3结论与讨论
本实验参考国标GB 5009.3-2016《食品中氨基酸的测定》（16种水解氨基酸的测定），对食品中16种水解氨基酸进行了测定和方法学验证分析。结果表明，本方法具有线性关系良好、结果准确、重现性好、回收率高的特点，可用作为食品中16种水解氨基酸的测定方法。许有诚等采用氨基酸分析仪、茚三酮柱后衍生法测定口服水解蛋白液中各种氨基酸的含量，实验结果证明各种氨基酸峰面积对浓度的线性关系良好，精密度、重复性、稳定性、回收率均达到要求，方法可靠，结果准确，与本实验结果相同。
 
参考文献：
[1]张琦,高娅,潘鑫,骞帆,邬晓勇.成都平原两季收获的藜麦中氨基酸的组成及其营养评价[J/OL].食品与发酵工业:1-15[2022-11-28].DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033324.
[2]宋国安.氨基酸的合成及其在食品中的应用[J].武汉工业学院学报,2000,(04):30-32.
[3]邵士慧.食品中氨基酸的作用及测定方法[J].时代农机,2016,43(04):92+94.
[4]董树清,高瑞斌,张霞,王利涛,赵亮. 毛细管电泳直接紫外检测法分离分析食品中的氨基酸[C]//.第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会论文集,2014:256.
[5]蚁碧珍,王锦源.氨基酸分析仪测定蜂蜜氨基酸组成的研究[J].现代食品,2020(19):176-180.DOI:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2020.19.052.
[6]李磊,张权,刘文政,吴玉田.酸水解法测定大米中17种氨基酸的含量[J].微量元素与健康研究,2020,37(01):2.
[7]侯婷婷.氨基酸自动分析仪测定鹿皮膏中氨基酸的种类[J].品牌与标准化,2017(11):78-79.
[8]GB 5009.3-2016，食品安全国家标准食品中氨基酸的测定[S].
 
 
作者简介：李艳婷，女，1986年出生，微生物学专业，硕士，主要从事食用菌资源的开发利用研究。主持项目3项，其中2项为省级项目；作为主要参与人参与省级及以上项目7项；第一作者发表论文8篇；获得发明专利9项，其中第一发明人3项，国际专利2项；主持省级地方标准1项等。